МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
При подозрении на инфекционную болезнь для исследования берут живую больную рыбу, так как после смерти кишечная микрофлора быстро проникает в различные органы и ткани, затрудняя тем самым микробиологическое исследование и выявление истинного возбудителя. Лучше всего проводить параллельное исследование нескольких экземпляров (не менее пяти), находящихся в стадии острого проявления клинических признаков болезни. Пригодны для исследования и рыбы, находящиеся в подостром периоде. При хроническом течении болезни процент выявления больных рыб микробиологическими методами исследования снижается.
Лабораторная диагностика инфекционных болезней включает микроскопический, бактериологический и биологический методы исследований.
Микроскопическим методом изучают морфологические признаки возбудителей болезней: их форму, размеры, расположение в мазках, подвижность, форму и расположение жгутиков, способность воспринимать ту или иную окраску, отношение к окраске по Граму, споро- и капсулообразование.
Мазки делают из крови, слизи с поверхности тела, пораженных участков кожи и жабр, различных экссудатов и содержимого кишечника, а также мазки-отпечатки из внутренних органов, окрашивая их метиленовой синькой Леффлера, по Граму и краской Романовского - Гимза, по Цилю - Нильсену и другими специальными методами.
Бактериологический метод исследования более сложный. Заключается он в выделении возбудителя на искусственных питательных средах и изучении его биохимических свойств.
Для производства посевов инструменты (ножницы, пинцеты, скальпели) предварительно кипятят в течение 15-20 минут в воде и в процессе работы после каждой манипуляции помещают в стеклянную банку с денатурированным спиртом, затем протирают салфеткой и вновь помещают в спирт. Для следующей манипуляции они могут быть использованы после обжигания на пламени спиртовки.
Прежде чем приступить к посевам из внутренних органов рыбы, берут материал для микробиологического исследования из пораженных участков кожи и мускулатуры (слизь, язвы, абсцессы и т. п.).
Простерилизованным скальпелем делают соскобы с поверхности тела рыбы; полученный материал помещают на твердые питательные среды и растирают шпателем, сделанным из пастеровской пипетки. Язвы предварительно промывают стерильной водой или физиологическим раствором (материал берут с поверхности соскоба). Содержимое абсцессов набирают пастеровской пипеткой, вводя ее через струп, образующийся после прижигания шпателем поверхностно расположенных тканей.
Кровь для посева у крупных рыб берут из сердца, прокалывая стерильной пастеровской пипеткой под углом 60° по направлению к голове предварительно очищенное от слизи и чешуи место, расположенное между грудными плавниками. Пульсирующее сердце обычно само нагнетает кровь. Кровь из сердца можно взять и у вскрытой мелкой рыбы. Для посева необходимо 2-3 капли крови, причем первую каплю обычно удаляют или исследуют на наличие кровепаразитов.
Вскрытие рыбы производят на пробковых или деревянных досках, предварительно протертых денатурированным спиртом или 3-5%-ным раствором карболовой кислоты.
Рыбу укладывают на правый бок брюшной стороной к вскрывающему и фиксируют на доске в области головы и хвоста препаровальными иглами. Туловище рыбы с левой стороны освобождают от слизи и чешуи, удаляют грудной и брюшной плавники и весь бок протирают ватным тампоном, смоченным спиртом. Осторожно, чтобы не повредить кишечник, прокалывают острым концом одной из бранш ножниц брюшную стенку несколько выше ануса. Вскрытие начинают с разреза, идущего сначала дугообразно вперед и вверх к позвоночному столбу, а затем вперед и вниз к жаберной крышке за основание грудного плавника. Пинцетом отворачивают и удаляют брюшную стенку от анального отверстия до грудных плавников.
После вскрытия брюшной полости из внутренних органов (сердце, печень, селезенка, почки и другие органы), предварительно прижигая места укола, делают высевы на питательные среды. Отодвигая в сторону брюшной полости, освобождают перегородку околосердечной полости. Кровь берут из сердца, прокалывая оттянутым концом пастеровской пипетки прижженную сердечную мышцу. Посевы из кишечника делают в последнюю очередь.
Для выделения аэробной микрофлоры посевы делают на обычные питательные среды - мясо-пептонный бульон и агар с рН 7,2 - 7,4.
Для облегчения выделения Achromonas punctata можно использовать среду Шмиц - Шанделье (100 мл 3%-ного мясо-пептонно-го агара, 10 мл 3%-ного стерильного водного раствора краски конгорот, 5 мл 30%-ного стерильного раствора сахарозы, 0,5 мл 4%-ного водного раствора едкого натра). Среда, разлитая по бактериологическим чашкам, должна быть прозрачной и рубиново-красного цвета.
Для получения анаэробных культур необходимо обеспечить удаление растворенного кислорода из питательных сред и в дальнейшем оградить микробы от вредного влияния атмосферного воздуха. Наиболее просто анаэробиоз создается в средах, налитых в пробирки высоким столбиком с добавлением кусочков различных органов и тканей, покрытых сверху слоем растительного или минерального масла толщиной 6 - 8 мм (печеночный бульон, среда Китт - Тароцци и др.). Для удаления растворенного кислорода жидкие питательные среды перед посевами в пробирках подвергают кипячению на водяной бане в течение 10 минут.
Благоприятные условия для развития анаэробов создаются при выращивании в полужидком агаре (0,3 - 0,5%-ном) и на кровяном сахарном агаре.
В лабораторных условиях для создания анаэробиоза часто используют анаэростат или аппарат Аристовского. В анаэростате анаэробиоз создается откачиванием из него воздуха вакуумным насосом, а степень разрежения воздуха устанавливается по показанию вакуумметра. В аппарате Аристовского кислород из воздуха поглощается смесью гидросульфита натрия и углекислой соды.
При исследовании на микобактериоз посевы проводят на среду Петраньяни и специальные дифференциальные среды, применяемые в микробиологической практике.
Для выделения и культивирования патогенных для рыб грибов используют общепринятые в микологии среды, в частности агар Сабуро, 0,5%-ный полужидкий агар с 1% глюкозы, 3%-ный глюкозный агар, кровяной бульон, 2%-ный крахмальный агар, среду Чапека.
Посевы выдерживают в термостате при температуре 20 - 25° в течение 24 - 48 часов и более, в зависимости от интенсивности роста микробов и того возбудителя заболевания, которого предполагают выделить при данном исследовании.
При выделении чистых культур аэробных и анаэробных бактерий, а также грибов пользуются общепринятыми в микробиологии методами.
Получив чистый рост, приступают к изучению морфологических свойств микроскопией культур и биохимических свойств - посевом на среды с углеводами (глюкозой, лактозой, маннитом, сахарозой, мальтозой), на мясопептонную желатину, молоко с лакмусом, мясопептонный бульон с сероводородом и индолом и другие среды.
Изучая изменения питательных сред, на которые высеяна культура, приходят к заключению о наличии у возбудителя тех или иных биохимических свойств, что дает возможность отдифференцировать одного возбудителя от другого и назвать не только тип, но и вид его.
Серологический метод исследования, к сожалению, в ихтиопатологической практике, а тем более при диагностике болезней экзотических рыб, наименее разработан, хотя в микробиологии является важным звеном лабораторной диагностики. Сущность этого метода состоит в изучении таких свойств возбудителя, которые позволяют провести в ряде случаев более тонкую, подвидовую дифференциацию возбудителя болезни. В связи с неизученностью этого метода в ихтиопатологической практике мы не сочли необходимым описывать методики постановки многочисленных серологических реакций.
Биологический метод применяют при необходимости подтверждения патогенности выделенных культур. Как правило, культурами заражают тот же вид рыб, от которых они выделены, но необходимо быть уверенным, что рыбы, взятые для биопробы, с данным возбудителем болезни не встречались.
Несколько экземпляров рыб заражают тем или иным способом чистой двухсуточной бульонной культурой в дозе 0,1 - 0,2 мл и наблюдают в течение времени, необходимого для проявления клинических признаков болезни.
Одновременно ставят контроль: в отдельный аквариум помещают здоровых рыб того же вида и возраста; исключают контакт между аквариумами с подопытными и контрольными рыбами. Лучше, если они будут в разных комнатах. Закрепляют отдельный рыбоводный инвентарь.
Температура воды в аквариуме должна быть оптимальной для данного вида рыбы.
Биологическая проба считается положительной, если рыбы заболевают в сроки, соответствующие изучаемой болезни, и с характерными для этой болезни клиническими признаками, а в контроле все рыбы остаются здоровыми.
В случае гибели рыб проводят посевы из пораженных органов на искусственные питательные среды, выделяют чистые культуры и изучают свойства возбудителя методами, описанными выше.
Лабораторные методы исследования позволяют выделить возбудителя и, изучив его свойства, дифференцировать его от ряда сходных с ним микроорганизмов. Однако окончательный диагноз при инфекционных болезнях ставят с учетом эпизоотологических данных, симптомов болезни, результатов патологоанатомического вскрытия.