ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Паразитологическому исследованию необходимо подвергать живых или свежеуснувших рыб всех возрастных категорий.
Рыб вскрывают по методу, разработанному К. И. Скрябиным и модифицированному применительно к рыбам В. А. Догелем и Э. М. Ляйманом. (Техника вскрытия рыбы описана в разделе «Микробиологические методы исследования».)
Органы и ткани рыб исследуют в следующем порядке: кожа, плавники, ротовая полость, жабры, глаза, кровь, сердце, брюшная полость, печень, мочевой пузырь, половые органы, кишечник, мышцы, головной и спинной мозг.
Результаты исследования вносят в рабочий журнал, где указывают дату исследования, пол, возраст, длину рыбы, результаты паразитологического исследования с предварительным и окончательным определением вида паразитов.
Внешний покров. При наружном осмотре кожного покрова и плавников собирают, предварительно определяют и фиксируют для последующего изучения всех паразитов, видимых простым глазом (паразитические ракообразные, пиявки и др.). После этого приступают к микроскопии мазков из соскобов со всей поверхности тела или из нескольких участков (крупные рыбы). Скальпелем соскабливают слизь с кожного покрова и плавников, помещают ее на предметное стекло и смешивают с ранее нанесенными туда же 2-3 каплями прокипяченной и остуженной воды. Накрывают покровным стеклом и рассматривают сначала под лупой, а потом при малом увеличении микроскопа. Исследование рыб на возбудителя костиоза ведут при среднем и большом увеличении микроскопа. Кроме возбудителя костиоза, на коже рыб паразитируют другие жгутиконосцы, а также инфузории, моногенетические сосальщики, паразитические рачки. Весьма часто на них можно обнаружить споровиков, локализующихся в дермальных бугорках.
Крупных паразитов (рачков, гельминтов) подсчитывают в абсолютных числах, а мелких (споровиков, инфузорий и других простейших) - в относительных, то есть подсчитывают число паразитов в десяти полях зрения микроскопа и определяют средние показатели. При этом высчитывают по каждому паразиту в отдельности экстенсивность и интенсивность инвазии для каждого вида и возраста рыб.
В случае затруднения видового определения тех или иных паразитов их необходимо консервировать в соответствующих жидкостях и сохранять для дальнейшей камеральной обработки. На склянку обязательно наклеивают этикетку.
Жабры.Все жаберные дуги вынимают, помещают на предметное стекло, собирают всех видимых паразитов, их подсчитывают и фиксируют.
Соскоб с жаберных лепестков или целые жаберные дуги с несколькими каплями воды зажимают между двумя предметными стеклами так, чтобы они стали прозрачными, и исследуют при малом увеличении микроскопа.
Споровики, некоторые инфузории и личинки сосальщиков могут находиться не на поверхности жаберных лепестков, а в особых соединительнотканных образованиях (бугорках); обнаружить и извлечь их можно только после разрыва стенки бугорка при помощи препаровальных игл. В кровеносных сосудах жабр могут находиться яйца сангвиникол, споры и мицелии гриба.
Глаза. Для обнаружения паразитов глаза извлекают из глазных впадин, помещают на предметное стекло и вскрывают острыми ножницами с внутренней каудальной стороны. Извлеченное стекловидное тело, хрусталик и содержимое передней камеры глаза компрессируют между двумя предметными стеклами и просматривают при малом увеличении микроскопа. В глазах можно обнаружить личинки сосальщиков рода Diplostomulnm.
Кровь. Каплю крови наносят на обезжиренное предметное стекло, вносят для предотвращения свертывания немного 1%-ного раствора лимоннокислого натрия, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом. Для предотвращения высыхания крови края покровного стекла обмазывают вазелином. Одновременно несколько мазков крови высушивают на воздухе, фиксируют в метиловом спирте, окрашивают по Романовскому - Гимза или гематоксилином и также исследуют под микроскопом.
Брюшная полость. Брюшную полость вскрывают по методике, изложенной в разделе «Микробиологические методы исследования», с той только разницей, что при паразитологическом исследовании нет необходимости соблюдать условия стерильности. Дугообразный разрез к основанию левого грудного плавника начинают от анального отверстия, вводя непосредственно в него тупой конец одной из брани ножниц. Вскрытую брюшную полость осматривают, а имеющиеся на серозных покровах и брыжейке бугорки исследуют под микроскопом.
Сердце. Для исследования сердце помещают в бактериологическую чашку с физиологическим раствором, вскрывают его полости, промывают и образовавшийся осадок исследуют под микроскопом на наличие возбудителя сангвиниколеза.
Печень. Чтобы обнаружить паразитов, обитающих в печени, ее делят на небольшие кусочки, которые компрессируют и исследуют под лупой и затем при слабом увеличении микроскопа.
Желчный пузырь. Для обнаружения паразитов желчный пузырь вырезают, помещают на предметное стекло, разрезают ножницами, делают соскоб с внутренней оболочки стенки пузыря. Соскоб и сам желчный пузырь помещают между двумя предметными стеклами и исследуют под лупой и микроскопом. В желчном пузыре можно обнаружить простейших и сосальщиков.
Селезенка. Селезенку помещают между двумя стеклами, сжимают до прозрачности и исследуют под микроскопом.
Почки.Для обнаружения паразитов почки компрессируют и исследуют под микроскопом. В почках можно найти споровиков и яйца сосальщиков.
Плавательный пузырь. В случае необходимости соскоб с внутренней оболочки плавательного пузыря можно исследовать под микроскопом компрессорным методом.
Мочевой пузырь. Методика исследования сходна с исследованием желчного пузыря. В мочевом пузыре можно обнаружить сосальщиков, споровиков и инфузорий.
Половые органы. Для обнаружения паразитов железу по частям компрессируют между стеклами и просматривают под микроскопом.
В половых органах встречаются микроспоридии.
Желудочно-кишечный тракт. Пищевод, желудок и кишечник извлекают, освобождают от жира и печени, расправляют и вскрывают ножницами, начиная с пищевода. По ходу вскрытия обнаруженных крупных паразитов (ленточных и круглых червей, сосальщиков) извлекают и помещают в физиологический раствор. Содержимое из различных отделов желудочно-кишечного тракта исследуют компрессорным методом под микроскопом. Затем с помощью скальпеля делают глубокий соскоб со слизистой оболочки из нескольких мест и исследуют на наличие микроскопических паразитов (октомитус).
Мышцы. Чтобы обнаружить мелких паразитов, берут небольшие кусочки мышц из различных частей тела и исследуют компрессорным методом под лупой и под микроскопом при малом увеличении. В мышцах можно обнаружить споровика плистофору и его споры.
Головной и спинной мозг исследуют компрессорным методом. В этих органах можно обнаружить споровиков.
Методы окраски. Мазки кровина наличие кровепаразитов окрашивают азур-эозином по Романовскому - Гимза (0,8 г азура II, 3 г эозина, 250 мл химически чистого глицерина и 250 мл метилового спирта) или метиленовой синью по Машковскому (1 г метиленовой сини и 2,5 г буры растворяют в 100 мл горячей воды).
Готовую, имеющуюся в продаже краску Романовского перед окрашиванием разводят из расчета 2 - 3 капли на 1 мл нейтральной дистиллированной воды. Если готовая краска отсутствует, ее можно приготовить самим. Для этой цели 1 г азура II растворяют в 1 л прокипяченной дистиллированной воды (раствор № 1) и 1 г эозина - в 1 л воды (раствор № 2). Оба раствора хранят отдельно. Перед употреблением на 1 мл нейтральной дистиллированной воды прибавляют по две капли каждого раствора. Продолжительность окраски 20 - 40 минут. Эритроциты окрашиваются в красный или розовый цвет, протоплазма паразитов и лейкоцитов - в синий, ядра паразитов - в красный, а лейкоцитов - в фиолетовый.
Раствор метиленовой сини перед употреблением разводят дистиллированной водой 1:10 и окрашивают мазки в течение 30 секунд, затем промывают водой и дифференцируют в течение нескольких секунд 5 - 10%-ным водным раствором танина. Эритроциты получаются красновато-фиолетовые, протоплазма простейших кровепаразитов - ярко-голубая, ядра лейкоцитов фиолетовые.
Для изучения морфологии паразитических инфузорий применяют окраску железным гематоксилином по Гейденгайну (протрава 2 - 2,5%-ным раствором сернокислых железо-аммиачных квасцов - 1 - 2 часа, окраска их 1%-ным спиртовым раствором гематоксилина в течение нескольких часов и дифференциация 1%-ным раствором 5-10 минут). Окрашивать инфузории можно также гематоксилином Делафильда или квасцовым кармином.
Паразитических жгутиконосцев окрашивают железным гематокслином или по Романовскому - Гимза.
Слизистых споровиков окрашивают 1%-ным водным раствором метиленовой сини 30-60 минут, затем препарат промывают в воде, последовательно проводят через спирты возрастающей крепости (70, 80, 96°-ный и абсолютный) и просветляют ксилолом.
Трематод и цестод окрашивают квасцовым кармином. Фиксированные в спирте препараты промывают в течение нескольких часов в проточной или часто сменяемой воде, затем помещают в краску (от 1 минуты до нескольких часов в зависимости от толщины гельминта). Продолжительность окраски можно контролировать, исследуя препараты под микроскопом. Окрашенные препараты переносят в дистиллированную воду, где в течение нескольких минут тщательно промывают от краски. Отмытых от краски паразитов осторожно сушат фильтровальной бумагой и проводят через спирты возрастающей крепости (70, 80, 96°-ный), выдерживая в них несколько часов. Обезвоженных паразитов просветляют гвоздичным маслом и ксилолом.
Цестод, так же как и трематод, можно окрашивать гематеи-ном Майера (1 г гематеина растворяют в 1 л дистиллированной воды с последующим добавлением 0,2 г йодноватокислого натрия и 50 г калийных квасцов). Гематеин допускает как прогрессивное, так и регрессивное окрашивание (без дифференцировки или с ней). При прогрессивном способе красят только 30 минут, при регрессивном - в течение 24 часов. Во втором случае для дифференциации препарат обрабатывают в 1%-ном солянокислом спирте под контролем микроскопа с последующим тщательным отмыванием краски в проточной воде в течение 20 - 30 минут.
Хорошие результаты получают при окраске мелких цестод молочнокислым кармином по Блажину. Молочную кислоту разводят вдвое дистиллированной водой, добавляют в нее небольшое количество кармина (в зависимости от желаемой степени окраски) и жидкость кипятят. Красить лучше свежие, нефиксированные объекты. Продолжительность окраски контролируют под микроскопом, а в случае перекрашивания объект переносят в цельную молочную кислоту для обесцвечивания. Окрашенный препарат промывают в течение 20 - 60 минут водопроводной водой и помещают в бальзам.
Для окраски крупных цестод этот способ модифицирован. Цестод в течение суток промывают в проточной или часто сменяемой водопроводной воде при комнатной температуре. Затем гельминтов помещают на 4 - 6 часов в краску (0,3 г кармина на 100 мл 30%-ной молочной кислоты), контролируя интенсивность перекрашивания под микроскопом, после чего на сутки их переносят в дистиллированную воду с добавлением в нее трех капель раствора сернокислого железа и двух капель 1%-ного раствора карболовой кислоты. В дальнейшем цестод переносят на чистое большое стекло, расправляют на нем и высушивают при температуре 30 - 37° (не выше, иначе препарат сморщится). Высохший, очень плотно приставший к стеклу препарат заливают канадским бальзамом или канифолью, растворенной в смеси, состоящей из равных частей хлороформа и абсолютного спирта.
Паразитических рачков исследуют в той же жидкости, в которой они хранятся. Красить их не обязательно. Иногда прибегают к окраске борным кармином, эозином, сафранином.
Идентификацию паразитов производят по «Определителю паразитов пресноводных рыб СССР» (издательство АН СССР, 1962) или по схеме, приведенной в руководстве Э. М. Ляймана «Болезни рыб» (Сельхозиздат, 1963).